蛋白樣品制備中各類雜質(zhì)和雜蛋白的去除

蛋白樣品制備中，在細胞破碎之后，既可以利用特定蛋白質(zhì)的特性來分離某一類蛋白質(zhì)，比如親和純化，比如前面介紹的磷酸化蛋白富集，或者膜蛋白富集；另外一個考慮方向是去除雜質(zhì)----去掉樣品中某些非目標高豐度蛋白或者雜質(zhì)的干擾，同樣可以達到簡化樣本的目的。當然要小心“倒洗腳水的時候別把嬰兒也倒掉了”，一定要選擇可靠的產(chǎn)品。

比如，潛在疾病標志物的樣本來源就是血清或其他體液，此類樣本可以提供人蛋白質(zhì)組中絕大部分組份。然而用蛋白質(zhì)組分析方法鑒定疾病標志物zui大的挑戰(zhàn)來自于血清中大量的高豐度蛋白對檢測的干擾，血清中有大約55%的蛋白為白蛋白，而IgG大約占血清中蛋白總量的10-25%，這些高豐度蛋白的存在會增加低豐度蛋白檢測的難度，去除占血清總蛋白近75%的白蛋白和IgG將有助于更好地鑒定其他的蛋白。G-Biosciences的AlbuminOUT™白蛋白去除試劑盒堪稱白蛋白去除神器。血漿和腦脊髓液等樣本中，包含大量的白蛋白，從而封閉掉在二維凝膠電泳中發(fā)現(xiàn)和鑒定其他低豐度蛋白的可能。AlbuminOUT™白蛋白去除試劑盒被設(shè)計用來在這種樣本中大量去除白蛋白。

這種白蛋白去除方法是基于白蛋白和Cibachron藍色染料的結(jié)合。AlbuminOUT™被優(yōu)化從樣本中去除人的白蛋白。AlbuminOUT™使用快速離心柱方法，每個柱子含有0.2ml的染料結(jié)合樹脂，從而可以結(jié)合大于2mg的人白蛋白。AlbuminOUT™可以從5-50微升人血漿中去除大于98%的白蛋白。

離心柱形式可以在10分鐘內(nèi)去除白蛋白。高結(jié)合力的藍色染料結(jié)合樹脂可以從人，豬，羊，狗，兔，大鼠和牛樣本中達到瞬間的結(jié)合和去除白蛋白。AlbuminOUT™或許也可以從其他物種中去除白蛋白。適用于處理25或50個樣本。

Figure 1:  2D  analysis  of  whole  human  serum  before  (left)  and  after

(right) treatment with AlbminOUT^™.

產(chǎn)品特點：

• 從樣本中不到10分鐘的時間內(nèi)去除白蛋白
• 基于白蛋白和Cibachron藍色染料的結(jié)合
• 每個柱子的結(jié)合力大于2mg的人白蛋白
• 從5-50微升人血漿中去除大于98%的白蛋白

去垢劑如SDS、Tween、Tritonde等是蛋白樣品處理過程中常用的組分。去污劑在蛋白提取和樣本制備過程中是很重要的物質(zhì)，特別是研究疏水蛋白時。蛋白樣本中高濃度去污劑的存在能夠影響ELISA,IEF和蛋白的蛋白酶消化，以及用質(zhì)譜進行分析時抑制肽的離子化。

所謂請神容易送神難。要除掉這些去垢劑？G-Biosciences推出的DetergentOUT™ GB-S10去污劑去除柱子和樹脂專門設(shè)計用來除于蛋白或其他生物樣本中所含有的去污劑，樹脂能夠從蛋白水溶液和肽樣本中去除自由的，未結(jié)合的陰離子的，非離子或兩性離子的去污劑(e.g. SDS, Triton® X-100 或CHAPS)，同時對于下游進行的質(zhì)譜或其他技術(shù)的分析應(yīng)用帶來zui小的樣本丟失。

DetergentOUT™ GB-S10柱子在第三方的研究使用中表明*兼容DI-QTOF和 LC-MS/MS（請見參考文獻）。DetergentOUT™ GB-S10柱子的使用顯著增加到了檢測到的肽光譜的數(shù)量。除此之外，DetergentOUT™ GB-S10柱子對于去污劑有高度的結(jié)合容量，比如每毫升固定的樹脂可以結(jié)合6mg SDS和14mg Triton® X-100。

Table 1:  A comparison of the detergent removal rates and percentage protein recovery with DetergentOUT^™ GBS10.

Tag蛋白的純化

帶有融合標簽的表達產(chǎn)物----融合蛋白的純化通常也是緊接細胞破碎工作進行的。設(shè)計融合標簽的主要目的之一就是為了方便后繼的親和純化。目前zui為流行的融合標簽自然是His-Tag，和GST，來自G-Biosciences等公司都有質(zhì)量非常穩(wěn)定可靠的產(chǎn)品，種類還特別豐富，分別對應(yīng)不同的上樣量和工作壓力和流速的需要。筆者在這里介紹一下江湖中盛傳的Tag蛋白純化的“刀劍笑”，目的就是為在產(chǎn)品選擇上幫你省點事......

“橫刀”-蛋白親和純化GST樹脂

G-Biosciences的谷胱甘肽樹脂，用于分離GST重組蛋白

用來親和純化帶有GST標簽的蛋白。樹脂由還原性的谷胱甘肽通過10個碳原子的間隔臂共價偶聯(lián)到4%交聯(lián)的瓊脂糖上組成。每毫升樹脂可以結(jié)合大約8mg GST標簽蛋白。樹脂浸在20%的乙醇中。谷胱甘肽樹脂有單獨的樹脂也有試劑盒形式提供。除了用于洗脫的還原性谷胱甘肽之外，結(jié)合/沖洗和洗脫緩沖液也有提供。

產(chǎn)品特點：

• 用于純化GST蛋白
• 高載量，8mg/ml
• 配基密度，7-15μmoles 谷胱甘肽/ml
• 樹脂尺寸，50-160μm
• 樹脂結(jié)構(gòu)，4%交聯(lián)的瓊脂糖
• 10個碳原子的間隔臂

“名劍”-蛋白親和純化鎳螯合樹脂

用于分離6XHis標簽重組蛋白，高度結(jié)合效率和低的非特異性結(jié)合。

固定的金屬親和層析樹脂（IMAC）使用鎳離子來純化6XHis標簽蛋白。樹脂可以結(jié)合6X組氨酸殘基（6XHis），一種在蛋白純化中非常常用的標簽。樹脂由氨基二乙酸偶聯(lián)到6%交聯(lián)的瓊脂糖上組成。氨基二乙酸可以共價結(jié)合到鎳離子上，每毫升樹脂可以結(jié)合20-40μmoles鎳離子。

這種鎳螯合樹脂有單獨的樹脂也有離心柱形式供選擇。

特定的結(jié)合和洗脫緩沖液液可以提供，

100ml His結(jié)合/沖洗緩沖液

(10mM Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

100ml His洗脫緩沖液

(0.25M Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

產(chǎn)品特點：

• 用于純化6XHis標簽蛋白
• 高載量，大于50mg/ml
• 配基密度，每毫升樹脂結(jié)合20-40μmoles鎳離子
• 樹脂結(jié)構(gòu)，6%交聯(lián)的瓊脂糖

“笑三少”-鈣調(diào)蛋白樹脂

鈣調(diào)蛋白樹脂用于親和純化鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白（CBP），包括帶有CBP標簽的重組蛋白和真核生物中鈣調(diào)蛋白調(diào)控的蛋白。樹脂是4%的瓊脂糖偶聯(lián)到鈣調(diào)蛋白上，配基的密度是1ml樹脂大約是1mg鈣調(diào)蛋白。

鈣調(diào)蛋白樹脂有單獨的樹脂產(chǎn)品形式以及試劑盒形式，試劑盒包括：

5ml樹脂，

100ml鈣調(diào)蛋白結(jié)合/漂洗緩沖液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM CaCl2)

100ml鈣調(diào)蛋白洗脫緩沖液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM EGTA)

5個1ml離心空柱

5個空的小于5ml的重力流柱

緩沖液同時也可以單獨提供。

產(chǎn)品特點：

• 用于純化鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白
• 結(jié)合CBP標簽的重組蛋白
• 高載量，~1-3mg/ml
• 樹脂尺寸，50-160μm
• 樹脂結(jié)構(gòu)，4%高度交聯(lián)的瓊脂糖
• 配基密度，0.9-1.2mg 鈣調(diào)蛋白/ml 樹脂